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生物知識

詳述細胞凋亡實驗操作過程

作者:admin 來源:本站 發布時間: 2019-03-17 21:49  瀏覽次數:
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簡介 

 

細胞凋亡是指為維持內環境穩定,由基因控制的細胞自主的有序的死亡。細胞凋亡與細胞壞死不同,細胞凋亡是主動過程,它涉及一系列基因的激活、表達以及調控等的作用,是為更好地適應生存環境而主動爭取的一種死亡過程。細胞凋亡和細胞增殖都是生命的基本現象,是維持體內細胞數量動態平衡的基本措施。

細胞凋亡的形態學特征

在形態上可見凋亡細胞與周圍細胞脫離接觸,細胞變園,細胞膜向內皺縮、胞漿濃縮、內質網擴張、細胞核固縮破裂呈團塊狀或新月狀分布、內質網和細胞膜進一步融合將細胞分成多個完整包裹的凋亡小體,凋亡小體最后被吞噬細胞吞噬消化。在凋亡過程中細胞內容物并不釋放到細胞外,不會影響其它細胞,因而不引起炎癥反應。

細胞凋亡的生物化學特征

在生物化學上,多數細胞凋亡的過程中,內源性核酸內切酶活化,活性增加。核DNA隨機地在核小體的連接部位被酶切斷,降解為180-200bp或它的整倍數的各種片斷。如果對核DNA進行瓊脂糖電泳,可顯示以180-200bp為基數的DNA ladder(梯狀帶紋)的特征。

細胞凋亡實驗的原理

三尖杉酯堿對急性粒細胞白血病,急性單核白血病等有良好療效的抗腫瘤藥物。研究表明HT在0.02~5μg/ml范圍內作用2小時,即可誘導HL-60細胞凋亡,并表現出典型的凋亡特征。本實驗用1μg/ml HT在體外誘導培養的HL-60細胞發生凋亡,同時也有少數細胞發生壞死。

凋亡細胞的鑒定方法

用Hoechst33342和碘化丙啶(propidium iodide,PI)對細胞進行雙重染色,可以區別凋亡、壞死及正常細胞。

 

細胞膜是一選擇性的生物膜,一般的生物染料如PI等不能穿過質膜。當細胞壞死時,質膜不完整,PI就進入細胞內部,它可嵌入到DNA或RNA中,使壞死細胞著色,凋亡細胞和活細胞不著色。而一些活細胞染料由于為親脂性物質,可跨膜進入活細胞,因而可進行活細胞染色。Hoechst33342是一種活性熒光染料且毒性較弱,它是雙苯并咪唑的一種衍生物。與DNA特異結合(主要結合于A-T)堿基區),顯示凋亡細胞和活細胞。凡是看到有凋亡小體的細胞都是凋亡細胞。

實驗用品

1、試劑:

三尖杉酯堿(HT),300μg/ml,100mmol/L Tris-HCl(pH7.5),5mol/L EDTA緩沖液、堿性裂解液:0.2mol/L NaOH, 1%SDS、醋酸鈉:3mol/L KAc(pH4.8);異丙醇;70%乙醇;溴酚藍,蔗糖指示劑。TBE電泳緩沖液,1%瓊脂糖,溴乙錠。PI母液:500μg/ml;Ho33342母液:2mmol/L。 

2、儀器設備:

熒光顯微鏡,電泳儀,電泳槽,微量加樣器(1ml,100μl)0.5、1.5ml離心管,載玻片,蓋玻片。

3.實驗材料:

人早幼粒白血病HL-60細胞,用含10%小牛血清的RPMI1640培養基在37℃,5%CO2條件下培養。

實驗過程

1.三尖杉酯堿誘發HL-60細胞凋亡
(1)實驗前約24小時,接種兩瓶HL-60細胞,標記①、②,每瓶含約6ml培養液,置37℃,5%CO2培養箱培養。
(2)實驗前約2.5小時,當細胞密度達到70%,①號瓶加入三尖杉酯堿200μl,使終濃度為1μg/ml,②號瓶中加入同等量PBS(pH7.4)作對照。共同放入培養箱中繼續培養2.5小時。

2.Ho33342和PI雙重染色鑒別三種細胞
(1)染色:將瓶中的細胞搖勻取200μl于1.5ml的離心管中,加入Ho33342母液2μl,PI 20μl,染色15分鐘。
(2)滴片:取一載玻片用雙面膠圍成一小室,從離心管中各取以上染色后的細胞懸液10μl,加入小室內蓋上蓋玻片,熒光鏡下用紫外激發光,高倍鏡下觀察,區別三種細胞,并注意三者比例

注意事項

1、誘導培養HL-60細胞時間要準確;
2、熒光顯微鏡下觀察細胞時,由于熒光易碎滅,觀察時要盡量快


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